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10x Genomics空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
背景介紹
基因表達(dá)具有時(shí)間特異性和空間特異性。時(shí)間特異性通?？梢酝ㄟ^對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的樣本取材，再使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)來進(jìn)行解析。然而，空間特異性信息常常難以獲得。常規(guī)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序無法還原細(xì)胞所處的原始位置信息，而傳統(tǒng)的原位雜交技術(shù)又很難實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)。 10x Genomics Visium空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，可在組織原位以超高分辨率研究基因表達(dá)特征和空間分布。此外，結(jié)合單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和空間轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行聯(lián)合研究，可使空間位置的基因表達(dá)研究深入到超高分辨率的單細(xì)胞層次，對(duì)于癌癥、免疫、神經(jīng)、發(fā)育等領(lǐng)域，有著令人期待的應(yīng)用前景。
不同層面轉(zhuǎn)錄組研究
技術(shù)原理
對(duì)新鮮冷凍組織或FFPE組織進(jìn)行包埋和切片，并將其放置在基因表達(dá)玻片上的捕獲區(qū)內(nèi)（新鮮冷凍組織需先摸索組織切片的目標(biāo)區(qū)域透化條件 , 以便確定透化最佳條件）。基因表達(dá)芯片有4個(gè)點(diǎn)陣區(qū)域（6.5mmx6.5mm） ，每個(gè)點(diǎn)陣均含有4,992個(gè) barcoded spot（直徑為55 μm），每個(gè)spot有一個(gè)獨(dú)特條形碼序列用于位置定位。進(jìn)行H&E染色后，在明場(chǎng)顯微鏡下觀察玻片上的組織切片，之后對(duì)組織進(jìn)行透化處理，以釋放出細(xì)胞中的mRNA（新鮮冷凍組織）或連接的探針對(duì)（FFPE組織） 。這些mRNA或探針對(duì)與spot上帶有空間條形碼的寡核苷酸相結(jié)合。通過生成cDNA的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（新鮮冷凍組織）或延長(zhǎng)反應(yīng)（ FFPE組織）引入空間條形碼。將帶有條形碼的分子混合后進(jìn)行下游處理，制備出立即可測(cè)序的文庫(kù)。生成的10x條形碼文庫(kù)與Illumina測(cè)序儀上的標(biāo)準(zhǔn)短讀長(zhǎng)NGS測(cè)序兼容，能夠?qū)崿F(xiàn)整張組織切片的大規(guī)模轉(zhuǎn)錄分析。測(cè)序數(shù)據(jù)中空間條形碼序列將轉(zhuǎn)錄信息映射回組織切片中的起始位置，從而還原轉(zhuǎn)錄本在組織中的位置分布，實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)的空間可視化。
Visium空間基因表達(dá)玻片的組成
注： 每張玻片包含2個(gè)或4個(gè)捕獲區(qū)，每個(gè)捕獲區(qū)含有約5,000個(gè)帶有條形碼的數(shù)據(jù)點(diǎn)，而每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)又包含數(shù)百萬條帶空間條形碼的捕獲寡核苷酸。組織mRNA在釋放后與這些寡核苷酸結(jié)合，可實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)信息的捕獲。
Visium空間基因表達(dá)的流程圖
注： 對(duì)新鮮冷凍組織或FFPE組織進(jìn)行切片，并將其放置在文庫(kù)制備玻片上，然后進(jìn)行固定，通過H&E或免疫熒光（IF） 染色并成像，接著添加空間條形碼并構(gòu)建文庫(kù)。對(duì)制備好的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，并對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化。
結(jié)果展示
分群可視化結(jié)果（左）；Spots分群圖（中）；Marker基因表達(dá)熱圖（右）
亞群聚類熱圖（左）；基因Term關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖（中）；GSEA富集分析（右）
產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
雙重信息
實(shí)現(xiàn)基因表達(dá)數(shù)據(jù)與空間定位信息的結(jié)合，解析多種類型組織切片樣本中基因表達(dá)譜；
分辨率高
每個(gè)芯片點(diǎn)陣包含近5,000個(gè)spot，每個(gè)spot平均分辨率為1至10個(gè)細(xì)胞，可以檢測(cè)幾千個(gè)基因；
結(jié)果無偏
無需組織解離，保留組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞微環(huán)境，鑒定異質(zhì)性組織中細(xì)胞類型；特殊UMI設(shè)計(jì)，避免反轉(zhuǎn)錄偏好性，降低誤差；
FFPE兼容
突破從FFPE（石蠟包埋）組織中獲取空間基因表達(dá)信息的障礙；
平臺(tái)完善
具有冷凍切片機(jī)、超高分辨率顯微鏡、 10x Genomics Visium等服務(wù)平臺(tái)；
團(tuán)隊(duì)專業(yè)
中科院博士帶領(lǐng)專業(yè)實(shí)驗(yàn)團(tuán)隊(duì)?，F(xiàn)已累積50余種不同組織類型、數(shù)百余個(gè)樣品的空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)。
送樣要求
與單細(xì)胞聯(lián)合分析
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能很好的揭示了組織異質(zhì)性，但由于獲取細(xì)胞懸液時(shí)對(duì)組織進(jìn)行了酶解，從而導(dǎo)致組織空間位置信息丟失。而空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)可以同時(shí)提供空間位置信息和基因表達(dá)信息，但檢測(cè)的單位不是單細(xì)胞水平，綜合運(yùn)用單細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)和空間轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)技術(shù)將兩種檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行聯(lián)合分析，對(duì)空間轉(zhuǎn)錄組的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行精確的細(xì)胞類型注釋，從而在不同應(yīng)用場(chǎng)景中更加精準(zhǔn)的揭示細(xì)胞相互作用和組織理解。
空間轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組整合研究應(yīng)用場(chǎng)景
應(yīng)用方向
腫瘤研究： 腫瘤微環(huán)境、腫瘤異質(zhì)性；
免疫研究： 免疫微環(huán)境；
發(fā)育生物學(xué)： 細(xì)胞類型的空間分布、時(shí)空變化；
腦神經(jīng)學(xué)： 神經(jīng)系統(tǒng)研究、腦圖譜構(gòu)建；
病理學(xué)： 病例切片的空間基因表達(dá)信息；
細(xì)胞圖譜： 構(gòu)建三維空間圖譜。
應(yīng)用案例
單細(xì)胞分辨率下人類腸道發(fā)育的時(shí)空分析
Spatiotemporal analysis of human intestinal development at single-cell resolution
發(fā)表雜志： Cell（IF: 41.582）； 發(fā)表時(shí)間： 2021年 2月； 應(yīng)用技術(shù)： 10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序， 10x Genomics空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序
本研究將單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序進(jìn)行聯(lián)合，繪制了隨時(shí)間變化的腸道形態(tài)發(fā)生。確定了101個(gè)細(xì)胞狀態(tài)，包括上皮細(xì)胞和間充質(zhì)祖細(xì)胞群以及與關(guān)鍵形態(tài)發(fā)生相關(guān)的重要階段過程。描述了隱窩-絨毛軸形成的原理，神經(jīng)、血管、間充質(zhì)形態(tài)發(fā)生和腸道的免疫種群，鑒定了發(fā)育中的成纖維細(xì)胞和肌纖維細(xì)胞亞型的分化層次，并闡述了它們的不同功能。明確了佩爾斑和腸道相關(guān)淋巴組織的起源，并描述了位置特異性免疫程序。本研究使用這一資源來呈現(xiàn)了形態(tài)發(fā)生梯度的無偏分析，這一梯度能夠指導(dǎo)細(xì)胞分化的連續(xù)波并定義與罕見發(fā)育性腸道疾病相關(guān)的細(xì)胞和位置，匯編了一個(gè)公開可用的在線資源，即胎兒腸道發(fā)育的時(shí)空分析資源（STAR-FINDer），以期促進(jìn)后續(xù)的相關(guān)研究工作。
腸發(fā)育圖譜研究技術(shù)路線
空間轉(zhuǎn)錄組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序整合對(duì)腸道發(fā)育的時(shí)空分析
