發(fā)布日期：2022-05-06 15:17:52
Single-cell landscape of immunological responses in patients with COVID-19
2020年7月，Nature Immunology 發(fā)表了關(guān)于新冠病人免疫反應(yīng)的單細胞全景圖譜研究，該研究利用10X單細胞轉(zhuǎn)錄組測序+單細胞TCR&BCR免疫組庫測序技術(shù)，對5個健康人和13和新冠患者的PBMC樣本測序分析。通過確定免疫細胞的轉(zhuǎn)錄譜，結(jié)合組裝好的T細胞受體和B細胞受體序列，分析免疫細胞的功能特性。COVID-19患者的大多數(shù)細胞類型顯示出強烈的干擾素-α反應(yīng)和整體急性炎癥反應(yīng)。此外，高細胞毒性效應(yīng)T細胞亞群的密集擴張，如CD4+效應(yīng)因子-gnly 、CD8+效應(yīng)因子-gnly和NKT CD160，與中度患者的康復(fù)相關(guān)。在重癥患者中，免疫系統(tǒng)的特點是干擾素反應(yīng)紊亂，嚴重的免疫衰竭，扭曲的T細胞受體庫和廣泛的T細胞擴張。這些發(fā)現(xiàn)提示了疾病進展過程中免疫反應(yīng)的動態(tài)性質(zhì)。
一. 研究背景及意義
在新冠肺炎中，疾病嚴重程度與宿主免疫應(yīng)答之間的關(guān)系尚不完全清楚。研究描繪了在COVID-19疾病進展過程中血液免疫細胞的高分辨率轉(zhuǎn)錄情況，這將有助于更好地理解疾病的保護性和致病性免疫反應(yīng)。
二. 樣本
5個健康人、13個患者(中度7,重度4和恢復(fù)期6，有4個與中度的配對），PBMC
三. 技術(shù)
10X單細胞轉(zhuǎn)錄組測序+單細胞TCR&BCR免疫組庫測序
四.結(jié)論
1.外周血免疫細胞的單細胞表達譜概述
繪制了122,542 個單細胞聚類圖，14個細胞類型及各類型的marker基因的在整體中的表達情況。明確了外周血細胞的組成。
2.不同疾病狀態(tài)下細胞組成的差異
2.1 為了揭示中度、重度和恢復(fù)期新冠肺炎患者與健康人相比細胞組成的差異，該研究對每個樣本的14個細胞類型的相對比例進行計算。在中度患者中，活化的T細胞群的相對百分比達到峰值，即使在恢復(fù)期也沒有恢復(fù)到正常水平；幼稚T細胞、MAIT細胞和mono DCs的相對豐度隨著疾病的嚴重程度而下降，這些群體后來在恢復(fù)期患者中恢復(fù)。
2.2 接下來，為了研究COVID-19感染期間的抗病毒和病原性免疫應(yīng)答，該團隊評估了兩個重要通路的表達水平。發(fā)現(xiàn)兩條GO通路在疾病中顯著高表達：干擾素(IFN)-α反應(yīng)與急性炎癥反應(yīng)。在COVID-19患者的pbmc中，IFN-α的應(yīng)答在所有主要細胞類型中均一致且顯著上調(diào)，在重癥患者中幾乎所有主要細胞類型的應(yīng)答均最高（除血漿B細胞在中度患者的IFN-α反應(yīng)最大外）。幾種細胞類型在急性炎癥反應(yīng)中表現(xiàn)出大致與疾病嚴重程度相對應(yīng)的趨勢，包括活化T細胞、γδ T細胞、NK細胞和CD16+單核細胞。
這些結(jié)果表明COVID-19患者存在強烈的整體促炎癥反應(yīng)。
3.在天然免疫細胞中觀察到強烈的干擾素反應(yīng)
進一步研究感染COVID-19之后的先天免疫細胞的轉(zhuǎn)錄組學變化，該團隊比較了CD14+和CD16+單核細胞在中度/重度與健康狀態(tài)下的表達達情況。發(fā)現(xiàn)顯著差異表達的基因參與了COVID-19患者的IFN反應(yīng)、髓樣白細胞激活、細胞因子產(chǎn)生和NF-κB信號通路。
這些結(jié)果表明，COVID-19患者的大多數(shù)先天免疫細胞類型顯示出強烈的IFN反應(yīng)。
4.COVID-19患者T細胞亞群表達特點
4.1 為了探究四種情況下個體間T細胞亞群的變化，研究者將PBMCs中的T細胞進一步分群，根據(jù)經(jīng)典T細胞標記物的表達和分布共獲得了12個亞群：包括CD4+ T細胞(CD3E+CD4+)的6種亞型、CD8+ T細胞的3種亞型(CD3E+CD8A+)和3種NKT細胞亞型(CD3E + CD4-CD8A-TYROBP +)。
4.2 在CD4+ T細胞的6個亞型中，除了naive CD4+ (CD4+ naive) T 細胞(CCR7+SELL+), memory CD4+ (CD4+ memory) T 細胞(S100A4+GPR183+), effector memory CD4+ (CD4+ effector memory) T 細胞 (S100A4+GPR183+GZMA+) 和 regulatory T (Treg) cell (FOXP3+IL2RA+) 亞型，該研究還定義了兩種新的CD4+效應(yīng)T細胞亞型：CD4+ effector-GZMK and CD4+ effector-GNLY，后者高表達細胞毒性相關(guān)基因如NKG7, GZMA, GZMB, GZMH 和GNLY，而前者高表達GZMK基因且低表達其他細胞毒性相關(guān)基因。
4.3 為了深入了解T細胞亞群的特征，研究者評估了在四種情況下每個亞群的分布情況。值得注意的是，與HDs相比，COVID-19患者中CD4+ naive、CD4+ memory、CD4+ effec- tor memory、Treg、CD8+ naive和NKT naive等naive狀態(tài)T細胞亞群比例下降。即使在恢復(fù)期，CD4+初發(fā)、CD8+初發(fā)和Treg的比例也沒有恢復(fù)到HDs的水平。相比之下，COVID-19患者中活動狀態(tài)T細胞亞群(包括CD4+效應(yīng)- gnly、CD8+效應(yīng)- gnly、NKT CD56和NKT CD160亞群)的比例增加，即使在conv患者中，這些細胞毒性亞群的比例也很高。特別值得注意的是，CD4+ effector-GNLY亞群在HDs中幾乎不存在，但在中、重度和conv患者中高度富集。此外，與中度患者相比，重度患者NKT CD160亞群的豐度明顯降低。
4.4 然后，研究者評估了四種條件下不同效應(yīng)態(tài)T細胞亞群的細胞毒性和衰竭評分。CD4+ effector-GNLY、CD8+ effector-GNLY、NKT CD56和NKT CD160亞群的細胞毒性評分高于其他亞群。在這些具有高度細胞毒性的亞群中，除了CD4+ effector-GNLY亞群外，HDs的細胞毒性評分最低，而中等水平的情況顯示出最高的細胞毒性狀態(tài)。CD4+ effector-GZMK、CD8+ effector-GZMK和NKT CD160組較其他亞群表現(xiàn)出更高的衰竭評分。在這些高度衰竭的亞群中，HDs都有最低的衰竭得分，而重度患者表現(xiàn)出最衰竭的狀態(tài)。
4.5 為了進一步研究COVID-19感染后T細胞轉(zhuǎn)錄組的差異變化，研究者比較了效應(yīng)T細胞(不包括CD4+ naive、CD4+ memory、CD8+ naive和NKT naive亞群)在中度、重度和HD患者中的表達譜。 發(fā)現(xiàn)COVID-19患者中表達上調(diào)的差異基因參與了包括IFN，細胞因子的產(chǎn)生，細胞殺傷，白細胞細胞粘附和細胞骨架組織等在內(nèi)的過程。此外，使用凋亡和遷移評分系統(tǒng)，觀察到嚴重患者的T細胞可能經(jīng)歷了遷移和凋亡。重癥患者PBMC中細胞死亡和遷移途徑的顯著激活提示，細胞死亡和淋巴細胞遷移可能與淋巴細胞減少有關(guān)，這是重癥COVID-19患者常見的現(xiàn)象。
5.在COVID-19患者中T細胞的克隆擴增和V(D)J基因的首選使用
5.1 接下來，為了深入了解單個T細胞之間的克隆關(guān)系和V(D)J基因在四種情況下的使用情況，研究者從TCR測序中重建了TCR序列。簡單地說，除三個NKT亞群外，所有亞群中有超過70%的細胞具有匹配的TCR信息。首先，與HDs相比，克隆擴增在COVID-19患者和恢復(fù)期患者中表現(xiàn)明顯；克隆擴增在中度和恢復(fù)期的程度高于重度期，同時，在嚴重的情況下，沒有大量的克隆擴增(克隆大小>100)，提示重癥患者可能缺乏有效的效應(yīng)T細胞克隆擴增。研究者觀察到T細胞亞群之間有不同程度的克隆擴增。
5.2 為了研究COVID-19和HDs患者TCRs的動態(tài)和基因偏好，我們比較了四種情況下V(D)J基因的使用情況。前10位CDR3序列在4種條件下均有差異。值得注意的是，研究者發(fā)現(xiàn)了V(D)J基因在COVID-19患者中的不同用法，多樣性降低，尤其是在TRA基因中更為明顯。研究者還發(fā)現(xiàn)與中度和恢復(fù)期患者相比，重度患者中TRAJ39和TRAJ43的表達較高。重度患者首選TRBJ基因為TRBJ1-1，而中度和非重度患者首選TRBJ2-1。V(D)J基因的選擇性使用表明，不同的免疫優(yōu)勢表位可能驅(qū)動T細胞反應(yīng)的分子組成，并可能與SARS-CoV- 2特異性感染有關(guān)。
6. COVID-19患者B細胞亞群特征
為了追蹤不同B細胞亞型的動態(tài)變化，研究者根據(jù)典型B細胞標記物的表達和分布將B細胞分為6個亞群：一個naive B亞群集(MS4A1+IGHD+)，一個memory B亞群(MS4A1+CD27+)，一個intermediate memory B 亞群(IGHD+CD27+ ），1個germinal center B 亞群(MS4A1+NEIL1+)和2個plasma亞群：plasma B (MZB1+CD38+)和dividing plasma B (MZB1+ CD38+MKI67+) 。值得注意的是，COVID-19患者活躍狀態(tài)B亞群(包括生發(fā)中心B、血漿B和血漿B分裂亞群)的比例比HDs患者增加。與HDs相比，COVID-19患者的記憶B細胞比例下降。
為了進一步研究SARS-CoV-2感染后B細胞轉(zhuǎn)錄組的差異變化，我們比較了中重度和HD患者B/漿細胞的表達譜。COVID-19患者中最顯著富集的差異基因涉及與IFN反應(yīng)相關(guān)的基因。此外，在重癥患者中，差異基因與蛋白質(zhì)合成、粘合和運輸相關(guān)的生物過程相關(guān)。這些結(jié)果揭示了COVID-19患者B細胞亞群的轉(zhuǎn)錄組特征。
7.重癥患者B細胞擴張與V(D)J基因特異性重排
研究者從BCR測序中重建了BCR序列，并分析了BCR克隆擴增的狀態(tài)。簡單地說，BCRs在每個集群中的檢出率都在75%以上。還發(fā)現(xiàn)，與其他三種情況相比，重癥患者的B細胞表現(xiàn)出明顯的克隆性擴增，說明重癥患者的B細胞活性和體液免疫應(yīng)答被強烈激活。這讓人想起其他研究者以前的觀察結(jié)果，較高的抗體滴度與較差的臨床結(jié)果相關(guān)。這引起了人們的關(guān)注，病原體導向的抗體可以促進疾病病理，導致類似于SARS觀察到的抗體依賴增強。
接下來，研究者分別評估了在中度、重度和恢復(fù)期疾病患者中IgA、IgD、IgG和IgM (IgE未檢測)的分布情況。在大多數(shù)患者中，IgM是主要的免疫球蛋白。與HDs相比，COVID-19患者的IgG含量增加，而IgM含量減少。在恢復(fù)期患者中，IgG和IgM水平恢復(fù)到與HDs相似的水平。
為了研究BCR的偏V(D)J重排，我們在四種條件下比較了V(D)J基因的使用情況。與其他三種情況相比，我們發(fā)現(xiàn)在嚴重情況下B細胞的V(D)J使用更有特異性，這表明在嚴重情況下B細胞可能經(jīng)歷了獨特和特異性的V(D)J重排。還發(fā)現(xiàn)，IGHJ4在所有HDs和患者中都得到了廣泛的應(yīng)用，但與其他三種情況下的患者相比，IGHJ4的配對IGHV基因在重癥患者中是不同的。還觀察到重度患者中IGHV3-7的過度表達。此外，在重癥患者中V-J頻率最高的兩對分別是IGHV3-7/IGHJ4和IGKV3-15/IGKJ3。綜上所述，重癥患者的B細胞克隆增加和IGHV和IGKJ基因的濫用提示SARS-CoV-2感染與宿主B細胞中的V(D)J重排有關(guān)。值得注意的是，在重癥患者中選擇性使用顯性IGV基因，特別是IGHV3-7和IGKV3-15，可能有助于疫苗的設(shè)計。
五. 總結(jié)
綜上所述，本研究中對SARS-CoV-2感染的復(fù)雜動態(tài)免疫反應(yīng)的綜合多細胞描述奠定了基礎(chǔ)。這些數(shù)據(jù)，加上詳細的基于TCR和bcr的血統(tǒng)信息，可以為深入了解COVID-19患者外周血淋巴細胞提供豐富的資源，為合理設(shè)計治療方案和開發(fā)sars - cov -2特異性疫苗鋪平道路。