生命科學(xué)中的許多重大發(fā)現(xiàn)都是從細(xì)胞與生物功能密切相關(guān)性中認(rèn)識(shí)到的。在發(fā)育生物學(xué)中，諸如子細(xì)胞之間的對稱破壞和細(xì)胞命運(yùn)決定等中心主題都是基于細(xì)胞之間的空間關(guān)系。在臨床環(huán)境中，組織病理學(xué)常被用作一種結(jié)論性的診斷工具，正是因?yàn)樵S多疾病的特征是組織中的空間特異性。感染和炎癥過程可以徹底改變組織中的細(xì)胞結(jié)構(gòu)。這些發(fā)現(xiàn)得到了包括原位雜交（ISH）和免疫組化在內(nèi)的分子生物學(xué)方法的支持，這些方法通過繪制組織內(nèi)的DNA、RNA和蛋白質(zhì)，提供了更直接可視化的生物過程。然而，這些方法一次最多只能分析少量的基因或蛋白質(zhì)。

“組學(xué)”革命深刻地改變了我們描述細(xì)胞特征的能力。新的方法可以檢測細(xì)胞中的全基因組、轉(zhuǎn)錄組或蛋白質(zhì)組，而不僅僅是一些RNA或蛋白質(zhì)標(biāo)記物?；蚪M測序、蛋白質(zhì)組學(xué)等分子圖譜技術(shù)已經(jīng)改變了生物醫(yī)學(xué)研究，但這些技術(shù)大多需要組織分離，導(dǎo)致組織形態(tài)和空間信息的丟失?？臻g分子圖譜技術(shù)的最新發(fā)展使得細(xì)胞能夠在保持其空間和形態(tài)完整的情況下進(jìn)行全面的分子表征。分子圖譜數(shù)據(jù)生成細(xì)胞的遺傳、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)組的深層特征，而組織圖像捕獲細(xì)胞的空間位置和形態(tài)特征。

雖然空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的關(guān)鍵，在可檢測基因的數(shù)量和可檢測組織的大小方面存在很大差異，但本文重點(diǎn)討論了能夠跨組織區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組水平檢測的技術(shù)。主要是空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)：1)基于NGS技術(shù)，在NGS測序前將位置信息編碼到轉(zhuǎn)錄本上；2)基于成像的方法，包括原位測序（ISS）——轉(zhuǎn)錄本在組織中擴(kuò)增和測序，和基于ISH的方法——成像探針在組織中被連續(xù)雜交。這些不同的技術(shù)可以被看作是匯聚在一個(gè)基因表達(dá)矩陣上，該矩陣捕獲了每個(gè)點(diǎn)（即一個(gè)像素、一個(gè)細(xì)胞或一組細(xì)胞）的轉(zhuǎn)錄組。

1.    基于NGS技術(shù)的方法

2016年發(fā)表的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)（ST）技術(shù)可以得到空間分辨的全轉(zhuǎn)錄組信息。2018年底，ST技術(shù)被10x Genomics公司收購并進(jìn)一步開發(fā)，命名為 "10x Visium"。10x Visium檢測法在分辨率（直徑55μm，條形碼區(qū)域之間的距離更?。┮约斑\(yùn)行時(shí)間上都有改進(jìn)。

Slide-seq代替在玻片上打印區(qū)域條形碼RT引物，它利用放置在載玻片上的隨機(jī)條形碼珠子來捕獲mRNA。在Slide-seq方法發(fā)表后不久，另一種使用更小的條形碼珠子的技術(shù)發(fā)布，命名為高分辨率空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)（HDST）。近期，開發(fā)了一種可在組織中使用確定性條形碼進(jìn)行空間組測序（DBiT-seq）的方法，該方法基于微流體的方法將條形碼傳遞到組織玻片的表面，以實(shí)現(xiàn)10μm像素大小的分辨率。Stereo-seq使用隨機(jī)條形碼DNA納米球沉積在陣列模式中，以實(shí)現(xiàn)納米級(jí)分辨率。Seq-scope已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了亞細(xì)胞分辨率的空間條形碼，可以用來可視化核和細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄。

在所有基于NGS的方法中，均為收集空間條形碼RNA并進(jìn)行測序。每個(gè)reads的條形碼用于繪制空間位置，而測序reads的其余部分被映射到基因組，以識(shí)別轉(zhuǎn)錄源，共同生成一個(gè)基因表達(dá)矩陣。

2. 基于成像的方法

本文介紹了兩種主要的基于圖像的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法：基于ISS和基于ISH的方法?；贗SS的方法直接讀出組織內(nèi)轉(zhuǎn)錄本的序列。具體來說，RNA被逆轉(zhuǎn)錄，通過滾圈擴(kuò)增，并進(jìn)行測序。BaristaSeq是另一種基于缺口填充掛鎖的方法，其讀取長度增加到15個(gè)堿基。STARmap使用條形碼掛鎖探針，與靶標(biāo)雜交，通過添加第二個(gè)引物，針對掛鎖探針旁邊的位點(diǎn)，避免了逆轉(zhuǎn)錄（RT）步驟。這種方法避免了cDNA轉(zhuǎn)換的效率障礙，并通過增加第二個(gè)雜交步驟來降低噪音。到目前為止，所提到的方法都是基于對靶標(biāo)的先驗(yàn)知識(shí)，F(xiàn)ISSEQ是一種非靶標(biāo)的方法，即捕獲所有種類的RNA。盡管非靶向擴(kuò)增會(huì)導(dǎo)致光學(xué)擁擠和靈敏度降低，但最近開發(fā)的擴(kuò)張測序（ExSeq）已經(jīng)證明其可以用于組織中的非靶向ISS 。

基于ISH的方法是基于成像的第二類方法，以ISH技術(shù)為基礎(chǔ)，通過互補(bǔ)熒光探針雜交檢測目標(biāo)序列。smFISH利用多條短的寡核苷酸探針（大約20 bp）來靶向同一mRNA轉(zhuǎn)錄本的不同區(qū)域。雖然smFISH具有高靈敏度和亞細(xì)胞空間分辨率，但由于標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡中光譜重疊的固有限制，它一次只能針對幾個(gè)基因。seqFISH是一種多路smFISH方法，通過連續(xù)幾輪雜交、成像和探針剝離，多次檢測單個(gè)轉(zhuǎn)錄本。然而，雜交輪數(shù)的增加需要增加smFISH探針的數(shù)量，這使得seqFISH既昂貴又耗時(shí)。為了彌補(bǔ)seqFISH的大量耗時(shí)，2015年發(fā)布了MERFISH技術(shù)。這種技術(shù)可以鑒定單個(gè)細(xì)胞中數(shù)千種RNA的拷貝數(shù)和空間定位。它利用組合標(biāo)簽、連續(xù)成像等技術(shù)來提高檢測通量，并通過二進(jìn)制條形碼來抵消單分子標(biāo)記和檢測錯(cuò)誤。

對于基于ISS和基于ISH的方法，是用圖像處理生成基因表達(dá)矩陣。為了獲得細(xì)胞級(jí)矩陣，要么手動(dòng)分割小區(qū)域，要么系統(tǒng)地使用計(jì)算方法對圖像進(jìn)行分割。雖然這些可能并不符合真正的物理邊界，但它們完成了將每個(gè)mRNA分配給細(xì)胞的任務(wù)?；蛘撸瑪?shù)據(jù)分析可以從單個(gè)像素水平開始，并結(jié)合基因表達(dá)數(shù)據(jù)來描繪細(xì)胞。

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)提供了一個(gè)基因表達(dá)矩陣

由于空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)提供了一個(gè)無偏的空間組成圖像，已被用于生成組織圖譜，作為參考提供了有價(jià)值的資源。

在神經(jīng)生物學(xué)方面：基于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的方法已經(jīng)建立了整個(gè)小鼠大腦或特定區(qū)域的詳細(xì)圖譜，如視覺皮層、初級(jí)運(yùn)動(dòng)皮層、中顳回、下丘腦視前區(qū)、海馬和小腦。相關(guān)研究在對背外側(cè)前額葉皮質(zhì)的分析中確定了已知精神分裂癥和孤獨(dú)癥相關(guān)基因的空間模式，從而提出了精神分裂癥遺傳易感性的機(jī)制。

在發(fā)育生物學(xué)中：時(shí)間分辨的空間轉(zhuǎn)錄組圖譜有助于闡明心臟發(fā)育、精子發(fā)生和腸道發(fā)育的空間動(dòng)力學(xué)。同樣，對人類子宮內(nèi)膜在月經(jīng)周期的增殖期和分泌期的全面研究發(fā)現(xiàn)了WNT和Notch信號(hào)在調(diào)節(jié)向纖毛或分泌型上皮細(xì)胞分化中的作用。這些圖譜一直是合作項(xiàng)目協(xié)調(diào)努力的重點(diǎn)，為研究界提供有效資源，并得到Human Cell Atlas項(xiàng)目和Allen Institute for Brain Science的支持。

除了正常的發(fā)育和生理之外，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)很適合研究疾病中的組織結(jié)構(gòu)紊亂。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠識(shí)別在癌癥中起作用的機(jī)制，即正常生理功能的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。隨著人們對腫瘤微環(huán)境重要性的日益認(rèn)識(shí)，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)已被用于研究其與不同狀態(tài)癌細(xì)胞的關(guān)系。特別是，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠研究癌癥和正常組織之間的分子特征。例如，在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)了免疫調(diào)節(jié)性癌細(xì)胞狀態(tài)。空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)還為神經(jīng)退行性疾?。òò柎暮Ｄ『图∥s側(cè)索硬化癥）、感染和炎癥過程（如麻風(fēng)病、流感和敗血癥）以及風(fēng)濕?。ò愶L(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和脊柱關(guān)節(jié)炎）中組織失調(diào)機(jī)制提供了見解。

空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)產(chǎn)生了一個(gè)基因表達(dá)矩陣，對其進(jìn)行分析既可以檢驗(yàn)現(xiàn)有的假設(shè)，也可以通過探索性分析產(chǎn)生新的觀察結(jié)果。鑒于空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集的復(fù)雜性和高維度，采用一種開放的思維方式，通過數(shù)據(jù)分析找到意想不到的關(guān)系，可以產(chǎn)生新的理解。

分析空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)通常需要排除低質(zhì)量數(shù)據(jù)和基因表達(dá)矩陣上的初始轉(zhuǎn)換，以提高信噪比，這可以使用分析軟件包（如Giotto、Seurat、STutility和stLearn）執(zhí)行。平滑算法可應(yīng)用于數(shù)據(jù)，以提高靈敏度，并消除技術(shù)和生物變化的不必要來源。基于相鄰點(diǎn)之間可以共享信息的前提，沿空間坐標(biāo)在移動(dòng)窗口中平均物理相鄰點(diǎn)之間的基因表達(dá)可以減少噪聲。類似地，通過調(diào)整數(shù)據(jù)比例，使數(shù)據(jù)在不同點(diǎn)上具有相同的平均值和方差（z-score），可以幫助進(jìn)行基因間的比較。

空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集的探索性數(shù)據(jù)分析操作示意圖

1. Cluster

聚類操作揭示了數(shù)據(jù)中的結(jié)構(gòu)，從最基本的角度定義了具有相似轉(zhuǎn)錄組的點(diǎn)集，或正交地，識(shí)別在點(diǎn)之間具有相似表達(dá)模式的基因?；蚓垲?，使用同樣的方法，可以識(shí)別與細(xì)胞類型或細(xì)胞狀態(tài)相對應(yīng)的共表達(dá)基因模塊。目前正在開發(fā)諸如BayesSpace之類的聚類方法，這些方法側(cè)重于空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的特定特征。

2. Select

典型的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集包含的生物信息比任何單一分析都要多。基因可以根據(jù)它們的空間自相關(guān)性(使用Moran’s I或Geary’s C)、鄰域富集(例如，在BinSpect中)或熵(例如，在Haystack中)來評(píng)分。Trendsceek使用接近的標(biāo)記點(diǎn)處理，能夠識(shí)別表達(dá)的熱點(diǎn)和梯度。SpatialDE利用高斯過程回歸將給定基因的表達(dá)變異分解為空間和非空間成分，SPARK也采用了類似的方法。

3. Score

雖然基因和spots是空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的主要觀察數(shù)據(jù)，但基礎(chǔ)生物學(xué)意味著基因作為模塊共同表達(dá)，spots轉(zhuǎn)錄組反映有限的細(xì)胞類型和狀態(tài)。這是評(píng)分函數(shù)的前提，評(píng)分函數(shù)用于將一組相似的點(diǎn)總結(jié)為單一基因表達(dá)譜，或正交地將一組連貫的基因總結(jié)為單一模式，以這種方式總結(jié)數(shù)據(jù)可以識(shí)別功能特性。評(píng)分可以簡單地通過對集合的值求平均值來完成，或者根據(jù)Seurat工作流中實(shí)現(xiàn)的零模型對表達(dá)式進(jìn)行評(píng)分。

4. Characterize

通過對空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)點(diǎn)群和基因集的操作識(shí)別的對象，必須具有生物學(xué)理解和解釋的特征。要實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，與其他數(shù)據(jù)源和其他先驗(yàn)知識(shí)的集成是必不可少的。當(dāng)一個(gè)集群與一個(gè)組織區(qū)域相匹配時(shí)，可以手動(dòng)描述spots的特征，如在MERFISH中注釋大腦中的單個(gè)細(xì)胞類型，在胰腺癌樣本中注釋腫瘤的正常和惡性區(qū)域。通過識(shí)別一組標(biāo)記基因并對其進(jìn)行特征描述，也可以間接地對一個(gè)簇進(jìn)行注釋。具體地說，基因集可以通過量化其與注釋基因集的重疊來描述。這是多模式交叉分析（MIA）和基因集富集分析（GSEA）的基礎(chǔ)，該分析可以從GO、KEGG、Hallmark 和其他數(shù)據(jù)庫中查詢獲得。

5. Relate

鑒于其系統(tǒng)性，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)非常適合于識(shí)別基因群體和組織區(qū)域之間的相似性、差異和關(guān)系。點(diǎn)簇可以通過查詢表達(dá)基因、空間重疊、發(fā)育或功能關(guān)系而相互關(guān)聯(lián)。例如RNA velocity利用未切片的轉(zhuǎn)錄本來推斷斑點(diǎn)在時(shí)間上是如何相互關(guān)聯(lián)的，并被應(yīng)用于皮層來繪制神經(jīng)發(fā)育的動(dòng)力學(xué)圖譜?；赗NA-seq的拷貝數(shù)變異推斷識(shí)別染色體非整倍體，可用于區(qū)分惡性斑點(diǎn)和非惡性斑點(diǎn)，并識(shí)別不同的亞克隆。當(dāng)兩組點(diǎn)在空間上相鄰時(shí)，可以通過使用已知數(shù)據(jù)庫（如CellPhoneDB或NicheNet）檢查它們的成對受體和配體來提出細(xì)胞之間的潛在相互作用模式。

數(shù)據(jù)分析操作路徑

健康或疾病組織的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)圖譜自然有助于無偏見的探索和假設(shè)生成。即使是那些設(shè)計(jì)用于研究特定生物過程的空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，如時(shí)間進(jìn)程研究或擾動(dòng)實(shí)驗(yàn)，也可以探索以揭示意想不到的變化并提出新的假說。從而利用數(shù)據(jù)集的高維性來產(chǎn)生可靠的生物推論。這些觀察到的細(xì)胞類型，基因表達(dá)的模式或兩種細(xì)胞狀態(tài)的共同定位可能推測一個(gè)新的可驗(yàn)證的假設(shè)。

此外，空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)可以被納入經(jīng)典的假設(shè)驅(qū)動(dòng)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中，使用充分有力的實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)一個(gè)定義明確的預(yù)測。事實(shí)上，隨著空間轉(zhuǎn)錄技術(shù)變得更加容易，它已經(jīng)準(zhǔn)備好作為一種常規(guī)的檢測方法，與流式細(xì)胞儀或RNA測序相提并論。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的指導(dǎo)下，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)在作為擾動(dòng)或時(shí)間歷程實(shí)驗(yàn)的讀數(shù)時(shí)可以證實(shí)或證偽一個(gè)假設(shè)。每個(gè)樣本都可以由一個(gè)單獨(dú)的數(shù)據(jù)點(diǎn)進(jìn)行匯總，并在不同的重復(fù)和條件下進(jìn)行比較，因此需要收集足夠數(shù)量的數(shù)據(jù)，以確保統(tǒng)計(jì)的嚴(yán)謹(jǐn)性和有效性。研究可能在同一樣本的多個(gè)切片上納入空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)，以解釋技術(shù)變異性，或每個(gè)條件下的多個(gè)生物重復(fù)。該假設(shè)可在模型系統(tǒng)、體外或體內(nèi)或臨床數(shù)據(jù)中進(jìn)一步驗(yàn)證。

利用空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的假設(shè)生成和檢驗(yàn)

隨著空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的分辨率和靈敏度的提高，與其他數(shù)據(jù)模式的集成可以為更好的組織表征提供機(jī)會(huì)。組織圖像本身可以提取高分辨率的信息，特別是結(jié)合組織病理學(xué)領(lǐng)域獲得的大量知識(shí)來手動(dòng)識(shí)別和注釋區(qū)域。在組織中檢測到的形態(tài)特征，如細(xì)胞形狀或細(xì)胞核大小，可以直接納入分析。在stLearn中，具有相似特征的點(diǎn)被識(shí)別出來，用對物理上接近而且在構(gòu)圖上相似的點(diǎn)進(jìn)行平均的方法使空間平滑性得以改進(jìn)。另一項(xiàng)研究則是通過將空間轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)數(shù)據(jù)與高分辨率組織學(xué)圖像數(shù)據(jù)融合，提高其分辨率。深度學(xué)習(xí)也被用于預(yù)測來自基因表達(dá)和組織學(xué)的細(xì)胞類型注釋，優(yōu)于單獨(dú)從任何一種方式預(yù)測的注釋。隨著可用于訓(xùn)練的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)的增加，機(jī)器學(xué)習(xí)算法也被用于預(yù)測組織病理學(xué)圖像中的基因表達(dá)。這些算法不依賴于預(yù)先定義的形態(tài)特征，而是通過將整個(gè)圖像分解來提高性能。將空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)與機(jī)器學(xué)習(xí)方法相結(jié)合，可以提高組織病理學(xué)的可解釋性，并在臨床決策中指導(dǎo)治療和告知預(yù)后。

在亞細(xì)胞分辨率下，染色質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)可能為不同環(huán)境下基因表達(dá)的調(diào)控提供線索。將空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集與基因組原位高通量成像以及組織中組蛋白標(biāo)記的空間分布相結(jié)合將是非常有價(jià)值的。最近，利用完整組織內(nèi)同步DNA測序的基因組組織進(jìn)行空間制圖已經(jīng)成為可能。這表明，將空間基因組測序與原位轉(zhuǎn)錄組分析相結(jié)合的目標(biāo)可能即將實(shí)現(xiàn)，從而加深我們對基因組組織和功能編碼方式的理解。

用蛋白質(zhì)聯(lián)合檢測等補(bǔ)充方式來增強(qiáng)基因表達(dá)數(shù)據(jù)，也可以闡明空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)沒有捕捉到的過程，如蛋白質(zhì)的翻譯后修飾和亞細(xì)胞定位及其在疾病中的失調(diào)。靶向蛋白聯(lián)合檢測可與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)同時(shí)進(jìn)行，在同一組織切片上使用免疫染色，如Visium所支持的那樣。DBiT-seq使用抗體衍生的DNA標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)組織中mRNA和蛋白質(zhì)的共映射。用于蛋白質(zhì)檢測的高通量空間方法，如MIBI、CODEX、t-cyCIF和自動(dòng)質(zhì)譜分析，為組織切片內(nèi)的蛋白質(zhì)組提供了無與倫比的快照。將這些高通量蛋白質(zhì)組學(xué)方法與空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)相結(jié)合的技術(shù)進(jìn)步將極大地提高我們研究組織復(fù)雜性的能力。

 隨著技術(shù)的不斷更新，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)領(lǐng)域正以指數(shù)級(jí)的速度增長。目前空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法面臨的挑戰(zhàn)，包括分辨率和靈敏度的限制，以及通量和可獲得性正在被迅速克服?？臻g轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法與石蠟包埋組織兼容，為回顧分析幾十年來收集的樣本打開了大門。隨著未來的創(chuàng)新，有可能系統(tǒng)性地分析更大的組織區(qū)域，以重建3D器官或生物體水平的圖譜，并將轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)的基因表達(dá)變化隨著時(shí)間的推移進(jìn)行可視化。除了克服這些技術(shù)上的挑戰(zhàn)，未來的工作還需要開發(fā)新的計(jì)算工具和創(chuàng)造性的分析思維。這些將使數(shù)據(jù)探索能夠識(shí)別空間模式(空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集的核心特征)，并揭示潛在生物學(xué)的見解。

人類基因組初稿于2001年發(fā)表，為研究遺傳變異的來源和結(jié)果提供了參考。然而，基因組不同區(qū)域的功能和調(diào)控仍在積極研究中。繪制每個(gè)基因在空間的表達(dá)水平圖譜只是闡明組織生物學(xué)的組織原則的第一步。正是這些高分辨率細(xì)胞圖譜與無假設(shè)查詢的耦合，將有助于獲得新的見解并揭示生理學(xué)和疾病中組織結(jié)構(gòu)的顯著特征。

這一領(lǐng)域的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)將是迭代構(gòu)建一個(gè)多細(xì)胞空間模式。這些更深刻的生物學(xué)見解將把我們對簡單組織的理解擴(kuò)展到更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，包括發(fā)育中的生物體和患病組織，使我們更接近于征服空間前沿。

1. 基因通量

基于NGS的方法是無偏向性的，因?yàn)樗鼈儾东@所有多聚腺苷酸化的轉(zhuǎn)錄本，因此非常適合探索新的系統(tǒng)。相比之下，ISH和大多數(shù)基于ISS的方法（FISSEQ和ExSeq除外）是有針對性的，需要對感興趣的基因有先驗(yàn)知識(shí)。盡管如此，這些方法的通量近年來有所增加，達(dá)到了10,000個(gè)基因。靶向的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法也可以與scRNA-seq結(jié)合使用，這樣就可以更精確地定位已經(jīng)識(shí)別的感興趣的基因。此外，非多聚腺苷酸化轉(zhuǎn)錄物的探針可用于查詢其他RNA，如成熟的microRNA和tRNA。

2. 序列信息

基于NGS和ISS的方法能夠檢測融合轉(zhuǎn)錄物、剪接異構(gòu)體和單核苷酸變體及點(diǎn)突變。當(dāng)與基因表達(dá)矩陣結(jié)合時(shí)，這些數(shù)據(jù)可以通過RNA速度或譜系追蹤幫助重建時(shí)間過程。

3. 靈敏度

基于ISH的方法靈敏度高，相對于金標(biāo)準(zhǔn)單分子熒光ISH (smFISH)，最近達(dá)到了80%的檢測效率。NGS-based方法的靈敏度明顯較低，仍然低于scRNA-seq，但正在迅速提高到大約100個(gè)獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄本/μm²。通常在敏感性和基因通量之間存在一種權(quán)衡，正如相對于非偏倚方法而言，基于ISS的靶向方法具有更高的敏感性。

4. 分辨率

原位方法的分辨率僅受光學(xué)衍射極限的限制，在擴(kuò)張顯微鏡下，分辨率已達(dá)到100 nm左右。因此，這些方法非常適用于有關(guān)亞細(xì)胞組織的問題?；贜GS的方法受限于spots的直徑，但其分辨率自最初的方法以來迅速提高，最近達(dá)到約1μm。

5. 尺寸范圍

盡管在組織大小和成像時(shí)間之間存在權(quán)衡，但原位方法可以跨越廣泛的尺寸范圍。相比之下，基于NGS的方法是標(biāo)準(zhǔn)化的，陣列大小約為10mm²（目前商用的10x Genomics Visium為5mm²），這可能不適用于較小或較大的樣本。

6. 可行性

盡管這些技術(shù)非常強(qiáng)大，但它們的廣泛應(yīng)用仍存在障礙，包括獲得用于原位方法的單分子成像，以及用于基于NGS方法的捕獲陣列的制造。商業(yè)化在某些情況下促進(jìn)了這些技術(shù)的應(yīng)用，如10x Genomics Visium。

參考文獻(xiàn)

Rao A, Barkley D, Fran?a GS, Yanai I. Exploring tissue architecture using spatial transcriptomics. Nature. 2021; 596(7871): 211-220.